羊抗人纖維蛋白原-RBITC抗體材料和方法

　　1.1 材料 人成骨肉瘤MG63細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。重組質(zhì)粒MycSSH1L(WT)、MycSSH1L(S937A S978A/2SA)以及recombinant cofilinHis6由王巖教授惠贈(zèng)。脂質(zhì)體 2000。高糖DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶和EDTA。A23187，KN93，CaM，重組Ca2+/CaMK Ⅱ(Rat Brain，Calbiochem)?？贵w：Myc (9E10;Roche)，HA (3F10;Roche)，Pcofilin，Cofilin(Santa Cruz)， CaMKⅡδ1δ4 (Trans Genic Inc.)，PCaMKⅡα/β(Thr286/287;Upstate)。免疫共沉淀(Protein Gagarose)試劑盒。

　　1.2 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) MG63細(xì)胞鋪于35 mmol/L培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí)，轉(zhuǎn)染MycSSH1L，48 h后換無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)3 h，分別加入濃度為0.5，1，2.5，5 μmol/L的A23187孵育10 min后裂解細(xì)胞，離心取上清加入凝膠加樣緩沖液,沸水浴上加熱5 min，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交〔一抗分別為Pcofilin、Cofilin、PCaMK Ⅱ δ及CaMK Ⅱ δ(14)〕、ECL顯色。

　　1.3 體外激酶測(cè)定 MycSSH1L(WT)及其突變體MycSSH1L(2 SA)分別轉(zhuǎn)染至MG63細(xì)胞，48 h后采用免疫共沉淀(Protein Gagarose)試劑盒的方法及抗cmyc抗體，對(duì)照組為抗IgG抗體?；厥誐ycSSH1L，加入0.6 μg/ml重組活性CaMKⅡ(單獨(dú)或同時(shí)加入抑制劑KN93)以及100 μmol/L ATP、5 μCi〔γ32P〕ATP 于 20 μl 激酶反應(yīng)緩沖液中，30℃反應(yīng)40 min。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，應(yīng)用放射自顯影技術(shù)檢測(cè)32P 標(biāo)記的SSH1L水平。

　　1.4 體外SSH1L磷酸酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn) MycSSH1L(WT)或MycSSH1L (2 SA)轉(zhuǎn)染至MG63細(xì)胞，48 h后，采用免疫共沉淀(Protein Gagarose)試劑盒的方法及抗cmyc抗體，對(duì)照組為抗IgG抗體。回收MycSSH1L，加入0.6 μg/ml CaMKⅡ(單獨(dú)或同時(shí)加入抑制劑KN93)，20 μg/ml CaM，以及 6.3 μg/ml cofilinHis6 于 20 μl 反應(yīng)緩沖液(50 mol/L HEPES，pH 7.4，0.1 mol/L CaCl2，0.5 mol/L EDTA，3 mol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，1 mol/L dithiothreitol，0.5 mg/ml BSA，1 μg/ml leupeptin),中30℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交(一抗分別為Pcofilin，Cofilin， cmyc 抗體)、ECL顯色。