Western Blotting技術(shù)服務(wù)

WESTERN BLOT是以電泳分離組分，將其從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固相支持體，繼之以針對特定氨基酸序列的特異性抗體作為探針檢測目的蛋白的一種分子生物學(xué)技術(shù)。  

免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)，它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。

我司為您提供全套免疫印跡(immunoblotting)技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用高質(zhì)量試劑完成

●主要實(shí)驗(yàn)步驟如下：  

1. 蛋白質(zhì)抽提

   a.實(shí)驗(yàn)對象為組織樣品，取適量（250~500mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。

   b.實(shí)驗(yàn)對象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。  

2. 蛋白質(zhì)定量

   按KCTMBCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。

3. 變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE)  

   將準(zhǔn)備好的樣品液和生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)第一個(gè)孔中，電泳分離蛋白。

4. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或PVDF膜

   按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉(zhuǎn)移過夜。

5. 膜的封閉和抗體孵育

   a. 膜在5％BSA溶液中室溫孵育1小時(shí)以封閉膜上的非特異結(jié)合。

   b. 封閉過的膜加入一級(jí)抗體室溫孵育1.5小時(shí)，抗原抗體結(jié)合。  

   c. 加入HRP標(biāo)記的二級(jí)抗體以結(jié)合一級(jí)抗體及HRP標(biāo)記的抗生物素抗體以結(jié)合分子量標(biāo)準(zhǔn)，室溫孵育膜1小時(shí)。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體可同時(shí)檢測GAPDH含量。

6. 結(jié)果檢測

   化學(xué)發(fā)光法檢測，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件，并用ImageJ分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化。

7. 數(shù)據(jù)分析

   目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。

8. 提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告

   包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)圖表。

客戶方需提供：

1、 第一抗體(建議客戶定購國外公司的一抗，以國外文獻(xiàn)中應(yīng)用的相關(guān)第一抗體為佳。

   如Cell signaling technology, Cayman Chemical, Santan Cruz, Zymed等著名抗體公司。)

2、 預(yù)實(shí)驗(yàn)樣本

3、 正式實(shí)驗(yàn)樣本

   同時(shí)希望客戶能提供相應(yīng)的背景材料以利實(shí)驗(yàn)順利完成，背景材料包括：樣本描述，目的蛋白相關(guān)資料，必要的相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)內(nèi)容如陽性對照等等。

★ 公司方提供：

1、 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2、 正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果

  如客戶只需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，我方可只代理預(yù)實(shí)驗(yàn)業(yè)務(wù)并提供結(jié)果。

★ 實(shí)驗(yàn)周期與費(fèi)用：

   預(yù)實(shí)驗(yàn)的費(fèi)用以欲檢測目的蛋白的種類數(shù)目（或第一抗體種類數(shù)目）計(jì)算，公司將在材料和實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)全部到位的工作日后15個(gè)工作日之內(nèi)提交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。正式實(shí)驗(yàn)費(fèi)用欲檢測目的蛋白的種類數(shù)目（或第一抗體種類數(shù)目）和樣本數(shù)為單位計(jì)算，實(shí)驗(yàn)周期為20個(gè)工作日，公司將在材料和預(yù)付的實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)全部到位的工作日后20個(gè)工作日之內(nèi)提交實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如客戶要求在10個(gè)工作日之內(nèi)完成，每單位樣品費(fèi)用為常規(guī)周期的兩倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以膠片的形式提交給客戶，客戶需在收到實(shí)驗(yàn)結(jié)果后一周內(nèi)付清所有剩余款項(xiàng)。