技術(shù)文獻(xiàn)
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血液RNA提取的方法可以細(xì)分為需要預(yù)先處理和不需要預(yù)先處理兩類。
眾所周知,人和其他哺乳動(dòng)物血液只有白細(xì)胞(不到總數(shù)的 5%)等少量細(xì)胞含有RNA,需要預(yù)先處理的血液 RNA 提取法其實(shí)就是分離白細(xì)胞再提取RNA, 本質(zhì)上是白細(xì)胞RNA提取。分離白細(xì)胞的方法有 Ficoll-Hypaque 密度離心法(白細(xì)胞在 Buffy Coat 中)和紅細(xì)胞裂解法。由于預(yù)處理操作會(huì)劇烈改變血液RNA含量(British J. Haematol., 126:231, 2004),所以無(wú)預(yù)處理 提取法將是未來(lái)提取血液RNA的發(fā)展方向。
白細(xì)胞RNA提取和全血RNA提取都需注意以下問(wèn)題:
一、血液越新鮮越 好,因血液細(xì)胞內(nèi)外都有大量 RNase,容易使RNA降解。血液在 4℃的放置 時(shí)間最好不要超過(guò)四天;
二、盡可能抑制或滅活血液特有的RNase(如 EDN, ECP),因?yàn)樗鼈儾坏?RNase A 一樣非常穩(wěn)定,而且不被 RNase Inhibitor 和 RVC 抑制,還能抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性,它們殘留在RNA樣品中不但會(huì)降解RNA,還會(huì)干擾后續(xù)的RT-PCR反應(yīng);
三,血液富含糖蛋白,粘蛋白和血紅蛋白,提取需要去除糖蛋白污染;
四,由于RNA量少,提取時(shí)很容易丟失, 可以適當(dāng)使用核酸沉淀助沉劑;
五,血液細(xì)胞量隨生理病理因素變化波動(dòng)性大, 注意調(diào)整血液和提取試劑的最佳用量。 最簡(jiǎn)單的方法是使用已經(jīng)經(jīng)過(guò)廠家優(yōu)化的產(chǎn)品,比如用于白細(xì)胞RNA提取的 TRIzol、QIAamp RNA Blood Mini Kit 和xuanya的動(dòng)物 RNAOUT;用于全血RNA 提取的 TRIzol LS,PAXgene Blood RNA Kit 和xuanya的全血RNAOUT和柱式血液RNAOUT。
眾所周知,人和其他哺乳動(dòng)物血液只有白細(xì)胞(不到總數(shù)的 5%)等少量細(xì)胞含有RNA,需要預(yù)先處理的血液 RNA 提取法其實(shí)就是分離白細(xì)胞再提取RNA, 本質(zhì)上是白細(xì)胞RNA提取。分離白細(xì)胞的方法有 Ficoll-Hypaque 密度離心法(白細(xì)胞在 Buffy Coat 中)和紅細(xì)胞裂解法。由于預(yù)處理操作會(huì)劇烈改變血液RNA含量(British J. Haematol., 126:231, 2004),所以無(wú)預(yù)處理 提取法將是未來(lái)提取血液RNA的發(fā)展方向。
白細(xì)胞RNA提取和全血RNA提取都需注意以下問(wèn)題:
一、血液越新鮮越 好,因血液細(xì)胞內(nèi)外都有大量 RNase,容易使RNA降解。血液在 4℃的放置 時(shí)間最好不要超過(guò)四天;
二、盡可能抑制或滅活血液特有的RNase(如 EDN, ECP),因?yàn)樗鼈儾坏?RNase A 一樣非常穩(wěn)定,而且不被 RNase Inhibitor 和 RVC 抑制,還能抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性,它們殘留在RNA樣品中不但會(huì)降解RNA,還會(huì)干擾后續(xù)的RT-PCR反應(yīng);
三,血液富含糖蛋白,粘蛋白和血紅蛋白,提取需要去除糖蛋白污染;
四,由于RNA量少,提取時(shí)很容易丟失, 可以適當(dāng)使用核酸沉淀助沉劑;
五,血液細(xì)胞量隨生理病理因素變化波動(dòng)性大, 注意調(diào)整血液和提取試劑的最佳用量。 最簡(jiǎn)單的方法是使用已經(jīng)經(jīng)過(guò)廠家優(yōu)化的產(chǎn)品,比如用于白細(xì)胞RNA提取的 TRIzol、QIAamp RNA Blood Mini Kit 和xuanya的動(dòng)物 RNAOUT;用于全血RNA 提取的 TRIzol LS,PAXgene Blood RNA Kit 和xuanya的全血RNAOUT和柱式血液RNAOUT。