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小鼠骨髓染紅細胞微核的測定方法
實驗原理
染色單體或染色體的無著絲點斷片,或因紡錘體受損而丟失的整個染色體,在細胞分裂后期,仍然遺留在細胞質中。末期之后,單獨形成一個或幾個規(guī)則的次核,被包含在子細胞的胞質內(nèi),因比主核小,故稱為微核。大小應為主核的1/20~1/5。微核的折光率及細胞化學反應性質和主核一樣。微核率是和用藥的劑量或輻射累積效應呈正相關,所以可用簡易的、快速、靈敏的微核計數(shù)來代替繁雜的畸變?nèi)旧w計數(shù)。Matter 和Schmid建立的微核測試是一種比較理想的方法,目前國內(nèi)外已把微核測試用于輻射損傷、化學誘變劑、新藥試驗、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。
實驗對象
成年健康小鼠,體重25g左右,雌雄均可。
實驗試劑與器材
(1)器材:顯微鏡、低速離心機、電子天平、解剖器械(搪瓷解剖盤、探針、剪刀、鑷子)、注射器、試管、試管架、磨口試劑瓶、滴管、染色缸、洗耳球、量筒、清潔載玻片。
(2)試劑:0.9%生理鹽水、滅活的小牛血清、環(huán)磷酰胺、甲醇、PBS (pH6.8)、Giemsa染液、瑞氏染液。
實驗方法與步驟
(1)環(huán)磷酰胺處理:取骨髓前24h先給小鼠腹腔注入環(huán)磷酰胺,注射劑量為100mg/kg動物體重。
(2)取骨髓:用損傷脊髓法處死小鼠,然后用剪刀剪開大腿上的皮膚和肌肉,取出大腿骨,用一小塊紗布來回搓干凈附在骨上的肌肉碎渣。剪掉股骨兩端膨大的關節(jié)頭,然后用注射器吸取5ml生理鹽水,插入股骨一端,將骨髓細胞沖洗至10ml的離心管中??芍貜蜎_洗多次,直至骨髓腔呈白色為止。
(3)離心處理:將所獲得的細胞懸浮液以1000rpm離心10min,吸去上清液,在沉淀物中加入2滴滅活的小牛血清,制成細胞懸液。
(4)涂片:滴一滴懸液于載玻片一端,按常規(guī)方法涂片,在空氣中晾干。
(5)固定:將晾干的載玻片放入甲醇固定液中10min,取出晾干。
(6)染色:將制片平放在玻璃板上,用1∶9∶10的Giemsa∶PBS∶瑞氏染液,染色15min,流水沖洗后晾干即可鏡檢。
(7)觀察:嗜多染紅細胞為年幼紅細胞,呈灰藍色,略大于紅細胞(紅色),微核多呈圓形和橢圓形,呈藍紫色或紫紅色(圖13-3)。
(8)結果分析:在顯微鏡下,每只小鼠骨髓涂片標本計數(shù)1000~2000個嗜多染紅細胞,包括其中出現(xiàn)微核的細胞數(shù),將結果填入表內(nèi),并計算微核細胞率,觀察記錄結果(表13-2)。按100mg/kg體重劑量給小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺,其嗜多染紅細胞微核率為(48.9±3.6)%。正常小鼠嗜多染紅細胞微核率為5‰以下,超過5‰為異常。